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【解構・諾貝爾獎】觀察入「微」:冷凍電子顯微鏡

2017/10/4 — 19:51

近年以冷凍電子顯微鏡建構的生物分子結構:圖左為控制生理節律的蛋白質、圖中為聽覺傳感器,而圖右為 Zika 病毒/Nobel Prize

近年以冷凍電子顯微鏡建構的生物分子結構:圖左為控制生理節律的蛋白質、圖中為聽覺傳感器,而圖右為 Zika 病毒/Nobel Prize

不少人中學時都有機會用到顯微鏡,透過鏡片可以觀察到從未想像過的微觀世界:報紙上一點一墨、植物上趣怪的細胞,或者是流動血液之中的紅血球等。

好奇心驅使科學家看得更細,透過冷凍電子顯微鏡 (Cryo-electron microscopy) ,科學家不只看到細胞,還能找出令化療無效和抗藥性的蛋白質、深入了解光合作用的過程,甚至了解人類聽覺的原理。近年,有科學家以冷凍電子顯微鏡了解 Zika 病毒的 3D 結構,由此找出潛在療法。

二十世紀初期,科學家開始知悉生物分子如蛋白質、DNA 和 RNA 等是生命基礎——但受科技所限,根本無從得知它們的「外貌」。直至 1950 年代,劍橋研究人員發現可以讓蛋白質結晶照射 X 光,從而觀察到它們扭曲的外貌。到 1980 年代,研究人員開始將這種稱為 X 光晶體學的技術配合核磁共振光譜法 (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) 以觀察蛋白質互動的活動。

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圖左為細菌視紫紅質 1975 年的模型 (Nature 257: 28-32) ;圖右則為 Henderson 於 1990 年發表的細菌視紫紅質 3D 結構圖。 (Henderson)

圖左為細菌視紫紅質 1975 年的模型 (Nature 257: 28-32) ;圖右則為 Henderson 於 1990 年發表的細菌視紫紅質 3D 結構圖。 (Henderson)

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雖然此兩方法為生物科學帶來不少貢獻,但同時亦有不少限制。今屆諾貝爾得獎者之一的 Richard Henderson 在研究途中,未能將細胞膜上的蛋白質晶體化。經過多番失敗,他最終放棄使用 X 光晶體學,轉以採用電子顯微鏡觀察。不過,電子顯微鏡同樣有問題:射出電子束太強會燒傷樣本、能量不足又不能得出清晰圖像,而且電子顯微鏡需要真空環境,周邊水份會因而蒸發,使生物分子結構變形。所幸的是,Henderson 研究的是一種名為「細菌視紫紅質 (Bacteriorphodopsin) 」的蛋白質。

這種紫色蛋白質會嵌入能光合作用生物的細胞膜之中接收陽光中的能量。Henderson 和同事將整個紫色細胞膜放到電子顯微鏡底下,並加入葡萄糖液以防它在真空下變乾。雖然電子顯微鏡一般需要以射出高能量電子,但 Henderson 等人反而以較弱能量電子射過細胞膜——得出對比度較差的初步圖像。但由於這種蛋白質以同一方向在細胞膜排列,當蛋白質的折射模式幾乎一樣時,他們就能以數學方式計算出蛋白質的圖像結構。最後,透過在不同角度拍攝蛋白質,他們最終拍到 7 埃米 (Ångström, 即 0.0000007 毫米) 的圖像。但 Henderson 並不滿足於此,經歷 15 年努力後,他終於在 1990 年成功拍到原子解像度圖片。

另一邊廂,身處美國的 Joachim Frank 亦發現方法改善顯影技術。透過電腦找出過千張電子穿過蛋白質留下的痕跡,並由此以電腦建構出高解像度的 2D 圖片。之後電腦再透過不同 2D 圖片,以數學運算出蛋白質的三維結構圖。在 1980 年中期, Frank 就以此技術發表了首個核糖體 (ribosome) 模型。而這個圖片處理技術則為之後的冷凍電子顯微鏡技術奠下基礙。

Dubochet 在 1984 年發表首輯病毒圖片/Nature, 308: 32-36

Dubochet 在 1984 年發表首輯病毒圖片/Nature, 308: 32-36

雖然 Henderson 以葡萄糖液防止細胞膜變乾,但方法不能用於水溶性生物分子。有部份科學家嘗試凍結樣本,但冰內的水晶結構卻會影響電子束。第三位諾貝爾得主 Jacques Dubochet 就想到方法解決此問題。他嘗試急速冷凍水份,使其變成「玻璃狀」而非「水晶」結構——而此方法正好令電子束平均照射樣本。發現可「玻璃化」水份後,Dubochet 和研究人員嘗試改良電子顯微鏡技術。最終在 1984 年,他們發表了一系列病毒圖書館,清晰顯示出病毒的不同形狀。

圖片左半為 2013 年前的解像度,圖片右片則為 2013 年的解像度。/Nobel Prize : Martin Högbom.

圖片左半為 2013 年前的解像度,圖片右片則為 2013 年的解像度。/Nobel Prize : Martin Högbom.

不過,電子顯微鏡的解像度仍未理想。回到 Frank 的實驗室,他以 Dubochet 的方法,加上自己的電腦程式觀察核糖體。最終雖然圖片解像度達 40 埃米,但仍然未能如 X 光晶體技術般,清晰顯示整個結構。多得 Henderson 不斷努力,最終在 2013 年,他終於成功解決最後一個難題,研發出新型電子測量器。而這些年來,不少新晉科學家成功以冷凍電子顯微鏡技術,一步步增加我們對「微觀世界」的了解,也促使不少醫療突破。

原文:
Nobel Prize, They captured life in atomic detail, 4 October 2017

文/Edward Ho、審核/Alan Chiu

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